原创：微谨生物

发表期刊：International Journal of Molecular Sciences

发表年份：2025

文章题目：Advances in Genetic Transformation of Lactic Acid Bacteria: Overcoming Barriers and Enhancing Plasmid Tools

通讯作者：Aleksei S. Rozanov、Leonid A. Shaposhnikov（俄罗斯天狼星科技大学）

原文链接：DOI 10.3390/ijms26189146

引言：乳酸菌遗传操作的主要屏障

乳酸菌（LAB）在食品发酵、益生菌递送和合成生物学中具有重要应用，但其遗传操作面临两大核心障碍：厚肽聚糖层形成的物理屏障，以及限制修饰（R-M）系统对未甲基化外源DNA的切割。许多菌株还对溶菌酶等细胞壁水解酶高度耐受，进一步增加了DNA导入难度。实践中，使用来自Dam⁻/Dcm⁻大肠杆菌的未甲基化质粒DNA，可有效规避R-M系统识别，使转化效率提升三个数量级以上。

DNA导入方法

1. 自然转化

自然转化是细菌主动摄取外源DNA的过程，需要细胞进入感受态。在LAB中，仅少数菌株存在天然感受态，如嗜热链球菌和部分乳酸乳球菌。通过添加合成感受态刺激肽和过表达ComX调控因子，可诱导这些菌株进入感受态，实现高达15 kb DNA片段的基因组整合。该方法可实现无标记编辑，但菌株依赖性极强，大多数LAB仍需人工转化。

图1. 革兰氏阳性菌肺炎链球菌的自然转化机制

感受态信息素（群体感应肽）分泌到胞外，浓度达阈值后与跨膜复合物ComD结合，触发磷酸化级联反应，激活ComX表达。ComX作为替代σ因子，启动晚期感受态基因表达，包括DNA摄取装置和重组系统，使细胞进入感受态，外源DNA被RecA/DprA包被后进行同源重组。

2. 电穿孔

电穿孔是LAB中最广泛使用的人工转化方法。短电脉冲在细胞膜上形成瞬时孔道，使DNA进入。优化关键因素包括：

a. 细胞壁弱化剂：

  • 甘氨酸：替代肽聚糖中的丙氨酸，抑制交联。6-8%甘氨酸可使植物乳杆菌转化效率提高30-100倍。
  • 氯化钠：0.9 M NaCl诱导渗透胁迫，削弱细胞壁，使干酪乳杆菌效率达10⁵ CFU/μg DNA。
  • 溶菌酶：水解肽聚糖，预处理可使效率提高30-1000倍。
  • 青霉素：抑制肽聚糖交联，效率提高480倍。
  • DL-苏氨酸：20-40 mM处理，使部分菌株获得转化能力。

b. 电脉冲参数：场强通常为12.5-15 kV/cm，电阻200-400 Ω，需针对菌株和生长阶段优化。

c. 恢复条件：使用含0.5 M蔗糖的恢复培养基，2-3小时恢复培养是关键。

图2. 电穿孔原理示意图

（A）向细胞悬液中加入质粒；（B）施加电脉冲，细胞壁形成瞬时孔道，质粒进入细胞；（C）移除电脉冲，孔道闭合，部分细胞获得质粒并在恢复培养后形成转化子。

3. 接合转移

接合通过细胞接触直接转移DNA，可绕过R-M屏障并转移大片段。常用滤膜杂交法或平板杂交法，供体-受体比例约1:1，杂交时间6-24小时。使用携带RP4转移系统的大肠杆菌S17-1作为供体，可将质粒高效转移至干酪乳杆菌，效率达1.8×10⁻³/供体。近期开发的XPORT诱导型接合系统，通过调控必需转移基因表达，实现可控的水平基因转移。

图3. 细菌接合转移示意图

供体细胞通过IV型分泌系统和接合菌毛与受体细胞连接，辅助质粒表达转移蛋白，供体质粒启动复制并立即通过松弛体-转移体装置进入受体细胞。

4. 噬菌体转导

噬菌体通过错误包装宿主DNA实现基因转移。在乳酸乳球菌、德氏乳杆菌和加氏乳杆菌中均有成功报道。LL-H噬菌体+pX3质粒系统在德氏乳杆菌中效率惊人，高达0.1-1转导颗粒/PFU，几乎全部噬菌体颗粒携带质粒DNA。加氏乳杆菌Φadh噬菌体系统也可高效递送质粒。但宿主范围窄是主要限制。

5. 基因枪

DNA包被的微粒（金、钨或纳米金刚石）经高压加速射入细胞，纯物理方法可突破顽固屏障。近期成功应用于长期难以转化的酒球菌。但设备昂贵、效率较低，仅作为最后手段。

表1. DNA导入方法比较

方法 典型效率 主要优点 主要缺点 最佳应用场景
自然转化 菌株依赖 无标记、基因组编辑 宿主范围极窄 嗜热链球菌等可诱导菌株
电穿孔 0⁴-10⁶ CFU/μg 快速、通用、可优化 菌株差异大、R-M敏感 常规质粒转化、多数实验室菌株<
接合 10⁻³-10⁻⁶/供体 可转移大片段、绕过R-M 需供体-受体匹配 顽固菌株、工业菌改良
转导 菌株依赖 自然过程、效率可极高 宿主范围窄、需特定噬菌体 有合适噬菌体系统时
基因枪 较低 物理穿透、不依赖生物学 设备昂贵、细胞死亡率高 其他方法均失败的顽固菌株
LAB质粒载体系统

1. 天然质粒与复制方式

LAB天然质粒主要采用两种复制方式：

a. 滚环复制（RCR）：拷贝数高，但结构不稳定性，适合<10 kb插入片段

b. θ复制：拷贝数低，稳定性高，可容纳大片段

2. 穿梭载体

同时带有LAB复制子和大肠杆菌复制子，便于克隆操作。常用复制子包括pWV01（RCR型，广宿主）、pAMβ1（θ型）等。代表载体：pLES003（基于短乳杆菌pLB925A03）、pGYC4α（基于清酒乳杆菌pYC2）、pSIP系列（基于清酒乳杆菌质粒，诱导型表达）。

3. 食品级筛选标记

避免使用抗生素抗性基因，采用：

a. 营养缺陷互补：如alr（丙氨酸消旋酶）基因。

b. 细菌素免疫：如nisI（乳酸链球菌素免疫）、lcn972（乳球菌素972免疫）。

c. 代谢标记：如oroP（乳清酸转运蛋白）。

4. 整合载体与温敏型质粒

自杀质粒：如pORI19，携带LAB复制子但缺失repA基因，需辅助质粒pVE6007提供RepA。通过温度切换控制整合。

温敏型质粒：如pG⁺host9，基于pWV01的温敏突变体。在30℃允许温度下复制，37-39℃非允许温度下强制整合染色体，广泛用于基因敲除和敲入，最终可获得无外源标记的食品级工程菌。

5. 多质粒共存的策略

不同复制子分属不同不相容群。使用pWV01来源与pAMβ1来源的质粒可在同一菌株中共存。当前已有针对不同复制子分类的系统研究，指导多基因表达系统的构建。

结论与展望

乳酸菌遗传操作已取得显著进展，研究人员可根据菌株特性选择合适方法：电穿孔适用最广，接合和转导可攻克顽固菌株，自然转化实现无标记编辑，基因枪作为最后手段。

未来优先方向包括针对不同菌株建立模块化优化流程；绘制菌株甲基化修饰图谱，指导DNA甲基化工程；开发更多广宿主、稳定遗传的复制子；将食品级载体与CRISPR等平台结合，实现高效无痕改造，这些进展将直接推动食品级工程菌和益生菌活体生物药的开发应用。

 

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