在生物制药领域，中国仓鼠卵巢（CHO）细胞凭借其快速增殖、遗传可操作性及复杂翻译后修饰能力，已成为治疗性蛋白生产的首选宿主系统。然而，高密度培养过程中持续高水平表达重组蛋白会引发内质网应激（ERS），激活未折叠蛋白反应（UPR）。如何精准调控UPR以平衡细胞存活与蛋白产量，一直是CHO细胞工程的关键挑战。
近期发表在《Synthetic and Systems Biotechnology》的一项研究首次揭示了膜联蛋白A1（ANXA1） 在CHO细胞中作为UPR抑制因子的功能。该研究中，微谨生物提供了PiggyBac转座子载体构建服务，助力研究者成功构建稳定ANXA1敲低细胞株。结果显示，重组抗体表达量提升4.5倍，单位细胞产率（qP）提升4.2倍。这一突破为CHO细胞工程化改造提供了全新靶点。

研究背景：UPR调控与ANXA1的潜在关联
UPR是细胞应对内质网应激的关键机制，通过ATF6、IRE1和PERK三条通路维持内质网稳态。既往研究表明，调控UPR组分（如BiP、XBP1s）可提升蛋白折叠能力、减轻应激反应，从而提高重组蛋白产量。
近年来，非经典应激调控因子逐渐进入研究者视野。ANXA1作为一种钙依赖性磷脂结合蛋白，在凋亡、炎症、囊泡运输及信号传导中发挥重要作用。值得注意的是，蛋白质组学与转录组学分析显示，ANXA1在高产与低产CHO细胞克隆中存在差异表达，但其功能机制一直未被阐明。
技术路线：稳定ANXA1敲低细胞株的构建与验证
本研究采用PiggyBac转座子系统构建稳定ANXA1敲低CHO细胞株，该系统具有高整合效率、最小插入偏好及长期表达稳定性等优势。
实验中设计了三条独立的shRNA靶向ANXA1，经qPCR与Western blot验证，筛选出敲低效率最优的shRNA用于后续实验。结果显示，ANXA1 mRNA水平下降6.3倍，蛋白水平显著下调，且敲低效果在7天悬浮培养过程中保持稳定。
核心发现一：ANXA1敲低显著提升重组蛋白产量
在7天悬浮培养中，ANXA1敲低组（shANXA1-ADM）的rADM产量较对照组提升4.88倍，ELISA检测确认抗体滴度提升4.45倍，单位细胞产率（qP）提升4.20倍。这一结果表明，ANXA1是CHO细胞生产能力的负调控因子。
此外，研究使用ANXA1特异性小分子抑制剂AC2-26处理低产CHO细胞系（ADM-14），结果显示70 μM AC2-26处理可使重组蛋白表达提升2.2倍，同时ANXA1的mRNA与蛋白水平均显著下调，进一步验证了ANXA1作为调控靶点的有效性。
核心发现二：UPR通路向适应性方向重塑
ANXA1敲低后，UPR的关键适应性因子显著上调：
  • PERK-eIF2α-ATF4通路激活：p-eIF2α与ATF4蛋白水平持续升高，促进抗氧化防御与自噬等适应性应激反应；
  • IRE1-XBP1通路激活：XBP1s/(XBP1u+XBP1s)剪接比例显著提高，表明IRE1 RNase活性增强，促进内质网扩张与分泌能力提升；
  • BiP上调：作为关键内质网伴侣蛋白，BiP的升高有助于修复错误折叠蛋白，提升蛋白折叠效率。
值得注意的是，尽管ATF4上调，但促凋亡因子CHOP的表达却显著降低，表明ANXA1敲低在激活适应性UPR的同时，抑制了促凋亡信号。
核心发现三：抗凋亡能力增强与自噬流激活
在凋亡调控方面，ANXA1敲低组表现出：
  • Bcl-2/Bax比值显著升高；
  • cleaved caspase-3水平明显降低；
  • 流式细胞术显示凋亡率下降至对照组的0.63倍；
  • JC-1染色显示线粒体膜电位稳定性增强。
在自噬调控方面，利用巴弗洛霉素A1（Baf A1）阻断自噬溶酶体降解后，ANXA1敲低组表现出更高的LC3-II累积量，而p62水平仍低于对照组，表明自噬流增强而非单纯自噬体形成增加。这一变化有助于清除错误折叠蛋白、回收营养资源，为重组蛋白高效合成提供有利的胞内环境。
核心发现四：代谢效率优化
代谢分析显示，ANXA1敲低组细胞表现出：
  • 葡萄糖消耗率提高，但乳酸产率显著降低；
  • 谷氨酰胺消耗与氨产量均下降。
这些变化表明ANXA1敲低促进了细胞向更高效的氧化磷酸化代谢转变，同时减少了有毒代谢副产物的积累。自噬的激活可能为细胞提供了额外的氨基酸来源，支持蛋白合成的同时降低对外源谷氨酰胺的依赖。
研究总结与展望
本研究首次揭示了ANXA1在CHO细胞中作为UPR负调控因子的功能。ANXA1敲低通过以下多层面机制协同提升重组蛋白产量：
  1. 激活适应性UPR通路（PERK和IRE1分支）；
  2. 增强内质网折叠与分泌能力；
  3. 抑制线粒体凋亡通路；
  4. 激活自噬流，优化胞内环境；
  5. 改善代谢效率，减少毒性副产物积累。
该研究不仅深化了对CHO细胞UPR调控网络的认识，也为工业生物制药中的细胞工程改造提供了新策略。靶向ANXA1——无论是通过基因工程还是小分子抑制剂——有望成为提升CHO细胞重组蛋白产量的有效手段。

微谨生物提供细胞敲低稳转试剂盒，该试剂盒相比于慢病毒构建敲低稳转细胞株，操作更简单，构建周期更短，价格更便宜。更多详情欢迎咨询13241131665（微信同号）。