产超广谱β-内酰胺酶肺炎克雷伯菌（ESBL-Kp）的广泛耐药性已成为全球公共卫生领域的重大威胁。面对“无药可用”的困境，亟需开发不同于传统抗生素的全新治疗策略。
近日，来自吉林大学第二医院的研究团队在BMC Microbiology期刊发表了题为“Beyond antibiotics: a new anti-virulence strategy combating ESBL-producing Klebsiella pneumoniae by targeting periplasmic trehalase”的研究论文。该研究首次揭示了周质海藻糖酶（TreA）作为ESBL-Kp关键毒力因子的重要作用，并提出了一种靶向TreA的抗毒力治疗新策略。值得一提的是，本研究所使用的ΔtreA基因敲除突变株由微谨生物（WenGene Biotechnology）构建提供，为研究的顺利开展奠定了重要基础。
研究背景
肺炎克雷伯菌是院内和社区获得性感染的重要病原体。随着β-内酰胺类抗生素的广泛使用，ESBL-Kp的检出率持续攀升，且这些菌株常同时对氨基糖苷类、喹诺酮类等多种抗菌药物共耐药，使临床治疗选择极为有限。
传统认为，细菌的耐药性和毒力之间存在“代价”关系，但近年来出现的“高风险”克隆株同时具备多重耐药和高毒力特性，迫使研究者寻找全新的抗感染策略。其中，“抗毒力疗法”因其靶向细菌毒力机制而非直接杀灭细菌，有望减少耐药选择压力，成为研究热点。
研究团队前期的蛋白质组学研究发现，TreA是ESBL-Kp中上调最为显著的白，提示其可能在耐药株的致病性中发挥关键作用。TreA定位于细菌周质空间，主要功能是将海藻糖水解为葡萄糖，为细菌提供碳源和能量。
关键发现
1. TreA缺失抑制ESBL-Kp的生长与高温耐受性
研究团队构建了treA基因敲除突变株（ΔtreA），并与野生株进行系统的表型比较。
  • 生长曲线分析显示：在对数生长期，野生株的生长速率明显快于ΔtreA突变株；进入平台期后，野生株的最大菌密度达到约5×10⁸ CFU/mL，而ΔtreA突变株仅达到约4×10⁸ CFU/mL，差异高度显著。
  • 高温胁迫实验表明：在45°C、55°C和65°C条件下，野生株的存活能力均显著强于ΔtreA突变株。例如在45°C处理120分钟后，野生株计数约为1.4×10⁵ CFU/mL，而ΔtreA突变株仅为约7×10⁴ CFU/mL。而在4°C低温条件下，两菌株的存活特性无显著差异，提示TreA特异性地参与高温应激响应。
2. TreA缺失削弱胞内存活与抗生素压力下的增殖能力
研究使用RAW264.7小鼠巨噬细胞系评估细菌胞内存活能力。实验设置了两种抗生素处理方案：
  • 阿米卡星组：仅清除胞外细菌，评估巨噬细胞自身的杀灭能力
  • 美罗培南组：模拟临床中抗生素与免疫系统协同清除的场景
结果显示：在美罗培南处理下，ΔtreA突变株在0h、2h和24h时间点的胞内菌量均显著低于野生株。比较两种抗生素的动力学趋势发现，高剂量美罗培南脉冲处理1小时后，对野生株和突变株的初始杀伤效果均显著强于阿米卡星，但随后2-24小时的清除速率无显著差异。

这表明TreA主要参与细菌的主动增殖和急性应激响应，而非普遍的持久性存留机制。


3. TreA是生物被膜形成的关键决定因子
研究采用结晶紫染色法评估两菌株的生物被膜形成能力。在10⁻¹至10⁻⁵系列稀释条件下，ΔtreA突变株在各个稀释度的生物被膜形成能力均显著低于野生株。例如在10⁻¹稀释度下，突变株的生物被膜OD₅₉₀较野生株降低了约37%；在10⁻⁵稀释度下，突变株仅形成野生株约48%的生物被膜量。

相关性分析显示，两菌株的OD₅₉₀与OD₆₀₀（反映生物被膜中细菌密度）均呈强正相关（野生株Pearson r = 0.9998，突变株r = 0.9989），提示TreA缺失不仅影响胞外聚合物的产生，还影响细菌在表面的生物量积累。


4. TreA缺失减弱小鼠肺感染模型中的毒力
研究建立了小鼠肺感染模型，通过气管内接种5×10⁴ CFU细菌。结果显示：
  • 体重变化：从感染后第1天起，野生株感染组存活小鼠的体重显著低于ΔtreA感染组
  • 生存率：ΔtreA感染组小鼠的生存率显著高于野生株感染组（P < 0.05）
  • 肺部细菌负荷：野生株感染组部分小鼠的肺部细菌载量高达10¹⁰ CFU/g，而ΔtreA感染组多数小鼠在10⁹ CFU/g左右，差异显著
这些体内实验结果表明，TreA缺失显著削弱了ESBL-Kp的侵袭和增殖能力。
机制讨论与临床意义
TreA的多重毒力调控机制
研究团队提出TreA通过以下机制影响ESBL-Kp的致病性：
  1. 能量代谢调控：TreA将海藻糖水解为葡萄糖，为细菌提供碳源和能量。treA缺失导致碳源利用效率下降，在营养竞争环境中产生生长劣势。
  2. 应激耐受：TreA通过调节胞内海藻糖水平，维持细胞在高温等不利条件下的结构稳定性。
  3. 生物被膜形成：生物被膜的形成需要大量能量和碳源，TreA介导的葡萄糖供应对胞外聚合物的产生至关重要。此外，TreA可能通过影响UDP-葡萄糖代谢通量，间接影响荚膜多糖的生物合成。
  4. 胞内存活：TreA增强细菌在巨噬细胞内的存活能力，这一机制在类鼻疽伯克霍尔德菌等病原体中同样存在，提示其为保守的毒力策略。
靶向TreA的“缴械-杀灭”联合策略
值得关注的是，本研究发现TreA抑制剂与常规抗生素（阿米卡星、美罗培南）可能具有协同效应。ΔtreA突变株在高浓度抗生素暴露后的初始存活率更低，且在后续低浓度维持阶段的反弹能力也显著受损。这一“缴械-杀灭”策略有望盘活现有抗生素、延缓耐药性发展。
研究局限与展望
研究团队指出，目前TreA影响生物被膜形成和胞内存活的具体机制尚未完全阐明，未来需要通过代谢组学和转录组学分析，量化treA缺失导致的具体代谢变化及其与毒力通路的直接联系。此外，TreA特异性抑制剂的开发和验证也是下一步的研究重点。
结论
本研究首次系统揭示了TreA作为ESBL-Kp关键毒力因子的重要作用。TreA通过保障能量供应、维持应激耐受、促进生物被膜形成和增强胞内存活等多种机制，全面提升ESBL-Kp的致病能力。靶向TreA的抗毒力策略，与现有抗生素联合应用，为应对多重耐药革兰阴性菌感染提供了全新方向。
本研究中的ΔtreA基因敲除突变株由微谨生物构建提供，再次验证了微谨生物在微生物基因功能研究领域的产品可靠性与专业技术支持能力。