大肠杆菌Nissle 1917（EcN）是益生菌领域的一个特殊存在——它是少数被证实对人类健康有益的革兰氏阴性菌，也是唯一被广泛研究的益生型大肠杆菌。自1917年从一名第一次世界大战士兵的肠道中分离以来，EcN已被用作治疗腹泻和炎症性肠病的益生菌制剂达数十年。近年来，随着活体生物药（Live Biotherapeutic Products，LBPs）概念的兴起，EcN正从“食品补充剂”向“处方活菌药”转型，成为多种LBPs的首选底盘菌株。然而，要将EcN改造为符合药物监管要求的工程菌株，基因编辑过程中的质控要求远高于普通实验室研究。

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EcN作为药物底盘的独特优势
EcN之所以成为LBPs的优选底盘，源于以下几个关键特性：
  • 安全性记录良好。EcN在临床上已有超过100年的使用历史，大量研究表明其具有良好的安全性。基因组测序显示EcN不携带典型大肠杆菌的毒力因子（如志贺毒素、肠毒素等），唯一的例外是其基因组中存在一个pks毒力岛，编码聚酮肽合成酶（colibactin），一种具有基因毒性活性的次级代谢产物。
  • 肠道定植能力强。EcN具有多种黏附素和铁摄取系统，使其能在肠道中有效定植并与病原菌竞争生态位。
  • 遗传可塑性高。与乳杆菌等革兰氏阳性益生菌相比，EcN的遗传操作更为便捷——可以利用大肠杆菌丰富的遗传工具库进行高效基因编辑。
EcN基因编辑中的特殊考量
考量一：pks毒力岛的评估与处理
EcN基因组中携带的pks毒力岛编码colibactin，该化合物可在真核细胞中诱导DNA双链断裂，引起染色体畸变。虽然EcN作为益生菌的整体安全性已经得到验证，但在将其开发为LBPs时，pks毒力岛的存在确实构成了额外的监管审核负担。
处理策略：可以通过基因敲除技术将pks毒力岛从EcN基因组中完全删除。删除pks后，菌株在细胞毒性实验中的安全性指标进一步提升，且不损害其益生功能。微谨生物提供EcN pks毒力岛的精准无痕敲除服务，为您的候选药物菌株消除潜在的安全顾虑。
考量二：无抗性标记编辑方案
活体生物药中使用的工程菌株不得携带抗生素抗性基因——这是监管机构的明确要求。因此，EcN的基因编辑必须采用无痕敲除方案，即通过反筛选系统（如SacB）去除抗性标记，最终交付的菌株基因组中不含任何外源抗性基因。
考量三：整合位点的安全性评估
在EcN中敲入治疗基因时，整合位点的选择至关重要。理想的整合位点应满足：不破坏任何必需基因、不位于毒力相关基因或可移动元件附近、在基因组中稳定存在不丢失。常用的安全整合位点包括lacZ基因座、attTn7位点等。
遗传稳定性验证：活菌药物质量控制的核心指标
对于基础研究而言，敲除菌株在验证过程中只要保持正确即可。但对于活菌药物开发而言，遗传稳定性是必须通过的标准——工程菌在模拟生产、制剂、储存和体内定植的过程中，编辑的基因不得发生回复突变或丢失。
遗传稳定性的验证方案包括：
  • 连续传代实验：在无筛选压力的条件下连续传代50代（模拟从生产到患者服用的全生命周期），每10代取样进行靶位点测序
  • 竞争性生长实验：将工程菌与野生型以1:1比例混合培养，定期监测两种菌的比例变化
  • 基因组重测序：对终产品菌株进行全基因组测序，确认除目标编辑外无其他非预期突变